求助：PCR扩增效率的如何计算

1. 求助：PCR扩增效率的如何计算

在网上搜到了两个计算realtime PCR扩增效率的公式，但相互不同，不知哪个才是正确的。请大家明辨！第一种计算： 
第二种计算方法：
两个都是通过标准曲线法计算扩增效率，其实是一样的，按照定义理解，完全扩增的话1条变2条，2条变4条，扩增效率200％，但一般通过软件计算都是提供第一种方法（用的比较多），扩增效率最大为100％。本质上两者是相同的。

2. 荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思

PCR原理中，反应一个循环，PCR产物扩增一倍，即为之前的2倍。……反应N个循环，理论上应为原来的2的N次方。此时，理论的扩增效率是100%，即1。
但实际上，由于酶，dNTPs，引物，模板等因素，扩增效率达不到100%。

因此，我们就要做标准曲线，看实际的扩增效率是多少，也就是标准曲线的斜率。理论上100%的扩增效率，换算出来的斜率是-3.32。

3. 如何提高扩增效率和PCR的特异性

引物
 
   
引物设计：引物长度适当，18-24mers，并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但长度大于24核苷的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量； 引物浓度：引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。  ---生物秀实验频道
   


Mg2+
   
较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行最适Mg2+浓度测定
   


退火温度
 
   
Tm对于设定PCR退火温度是必需的。退火温度一般设定为比引物的Tm低5℃的温度。合理的退火温度为55-70℃。在理想状态下，退火温度应足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合 ---生物秀实验频道www.bbioo.com
   


巢式PCR
   
使用巢式引物进行连续多轮扩增，由于同两套引物都互补的靶序列很少，巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，从而提高PCR反应的特异性和灵敏度
   


递减PCR
 
   
通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。这样，特异性最高的目的模板会被优先扩增，并在随后的循环中继续扩增占据优势
   


热启动PCR
 
   
通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度。最常用的是热启动DNA 聚合酶，常温时该酶活性被抑制，94-95℃加热数分钟后回复正常活力开始反应，这样可以避免起始循环温度下的非特异性扩增，大大提高了PCR反应的灵敏度及特异性。热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一
   


PCR增强剂
   
包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等，能构降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。

4. 荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思

PCR原理中,反应一个循环,PCR产物扩增一倍,即为之前的2倍.……反应N个循环,理论上应为原来的2的N次方.此时,理论的扩增效率是100%,即1.
但实际上,由于酶,dNTPs,引物,模板等因素,扩增效率达不到100%.
因此,我们就要做标准曲线,看实际的扩增效率是多少,也就是标准曲线的斜率.理论上100%的扩增效率,换算出来的斜率是-3.32.

5. 如何判断PCR扩增的效率是否一致？

你好，扩增曲线可以粗略地判断扩增效率。SYBR Green的双delta Ct法要求目的基因和内参的扩增效率基本一致。如果不一致，需要对公式进行修正，部分qPCR仪的配套软件可以做到，直接输入每对引物的扩增效率。但无论如何，保证高扩增效率是实验成功的关键。如果扩增效率一致，不同Ct的曲线显示出来就基本是平行的位移，其倾斜程度基本一致。而如下图一样，一条比较“陡”，另一条比较“平”，那么意味着扩增效率不一致。有可能是引物效率不一，或者个别样品、反应孔存在抑制PCR的污染等。

来自：肽度时界威客吴博士，有科研难题、科研需求就上肽度时界吧！

6. 荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思

PCR原理中,反应一个循环,PCR产物扩增一倍,即为之前的2倍.……反应N个循环,理论上应为原来的2的N次方.此时,理论的扩增效率是100%,即1.
  但实际上,由于酶,dNTPs,引物,模板等因素,扩增效率达不到100%.
  因此,我们就要做标准曲线,看实际的扩增效率是多少,也就是标准曲线的斜率.理论上100%的扩增效率,换算出来的斜率是-3.32.

7. PCR扩增的介绍

聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction） (又称：多聚酶链式反应) PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

8. PCR扩增仪的PCR的应用

用我自己的话说，就是pcr扩增仪是普通的pcr反应，反应后产物一般通过电泳查看结果。实时荧光pcr即real-timepcr，是在反应体系中加入目的基因的探针，pcr过程中，根据目标基因的表达量多少，探针可发荧光，rt-pcr仪通过检测荧光表达量来记录基因表达量，从而达到了同不定量检测基因表达量，不需要电泳辅助。
如果一步pcr反应即可达到目标就直接用实时荧光pcr即可快速检测，如果你的pcr反应需要两步（如巢式pcr），第一步可以用普通pcr扩增仪，当然第一步也可以用实时荧光pcr，不放探针就行了，你不觉得这有点奢侈吗......
价格，那得看哪产的了......一部进口的普通pcr可以比国产的rt-pcr贵很多。仪器也需要休息，我学校的一台普通扩增仪几乎一天用20个小时，到最后每天都会出问题，你舍得用进口的rt-pcr干这个嘛？pcr一页可以说一分钱一分货，举一个例子，进口的pcr有的可以将温度精确到0.1度，而且变温速度也很重要，关键是看你做的实验是否需要这么精确，是否需要进口高端级别的pcr