荧光定量PCR的界限值概念

1. 荧光定量PCR的界限值概念

荧光定量 PCR（Real-time PCR），是指在 PCR 扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

对照的目的是对检测的各个环节进行监控，因此我们按照检测的流程对对照进行梳理。常规荧光定量 PCR 的流程是：样品采集 - 运输 - 样品处理 - 核酸提取 - 反转录（RNA 病毒）- 扩增 - 结果读取。【摘要】
荧光定量PCR的界限值概念【提问】
荧光定量 PCR（Real-time PCR），是指在 PCR 扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

对照的目的是对检测的各个环节进行监控，因此我们按照检测的流程对对照进行梳理。常规荧光定量 PCR 的流程是：样品采集 - 运输 - 样品处理 - 核酸提取 - 反转录（RNA 病毒）- 扩增 - 结果读取。【回答】

2. 荧光定量PCR（一）— 基础介绍

当有入射光照射物质时，其分子会吸收入射光的能量从而受到激发使得其电子由低能级跃迁至高能级，此时处于激发态的分子其结构并不稳定，会通过跃迁而失去能量返回基态，这个过程会伴随着荧光或者磷光的产生。如图所示
                                          
 所有荧光物质都具有两个特征光谱，也即激发和发射光谱。
  
 通常情况下，物质的发射光波长总是大于其激发光波长，这是因为，物质在收到激发的过程中，存在着一定的能量损失。激发和发射光波长的差值称之为斯托克位移。
                                          
 荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或者化学作用过程
   荧光淬灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有如下几种类型
                                          
 荧光定量PCR技术是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。为了达到高效反应，应将实时PCR应用的引物设计为能生成短的扩增子。常用的方法有SYBR Green的荧光染料法和TaqMan探针法，两种方法的特点及应用如下表：
                                          
 由于目前不同荧光定量PCR仪的原理和提供的检测光光谱范围的差异，因此在选择探针的发光基团和淬灭基团时一定要根据所用的仪器型号设置的可检测的荧光信号范围内选择（探针法可连接我们的荧光定量PCR试剂盒的编号及对应的机器型号）
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                  
 由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes)，或称"TaqMan"探针，用于Real Time PCR实验。由于这些淬灭染料的光谱学性质不同(见下图)，作为淬灭基团使用时的特点也不同，现说明如下：

3. 荧光定量PCR的概述

荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

4. 做荧光定量PCR时，△△Ct值是什么意思，它的计算公式是什么

△△Ct = △Ct(试验样品) — △Ct(基准样品) 
△Ct(试验样品) = Ct（试验样品,目的基因） — Ct（试验样品,内参基因） 
△Ct(基准样品) = Ct（基准样品,目的基因） — Ct（基准样品,内参基因）
2 －△△Ct =2 －（－1.2）= 2.30

5. 荧光定量PCR有哪些注意要点

1.按照正确的开关机顺序操作,有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率.开机顺序：先开电脑,待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机,等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件,进行实验.关机顺序：确认实验已经结束后,首先关闭信号收集软件,然后关掉定量PCR仪主机的电源,最后关闭电脑.
2.应该定期备份您的实验数据,备份频率推荐每周一次,用光盘刻录.同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据,这些文件所在的目录是C：/Appliedbiosystems/SDS Document.
3.良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率.推荐做到以下几个方面：
电源：推荐配备合适的UPS或稳压器.
通风：仪器的通风应该没有阻挡.
温度：推荐实验室配备空调,温度应该控制在10-30°C之间.
湿度：20-80%；对于潮湿的省份,推荐实验室配备除湿机.
空间：易于操作,安全.
4.怎样判断定量PCR仪的样本加热块是否被污染?怎样清除污染
一个办法是运行背景校正反应板,当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号,则表明该孔可能被荧光污染物.另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下,执行ROI的校正,当某个孔的信号明显高出其他孔时,则表明该孔被污染.
清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中.吹打数次.将废液吸入废液杯中.重复以上步骤：乙醇三次,去离子水三次.确认反应孔中的残留液体蒸发完.

6. 荧光定量PCR的几个问题

1. 最好是测下浓度，把cDNA模板调整到100ng/反应再试试，PCR的循环调整到45
2. primer5 和oligo6的温度不会差很多的，两个软件都算好了，然后-3度 跑PCR
3. 做普通PCR把循环数增大到45试试，可能是你的基因的表达丰度太低了
4. 非特异性扩增不一定是引物的问题，另一个原因可能是你扩增的基因同源基因比较多，或者你设计的引物刚好在保守的domain区域，这样的情况即便引物再好，也很容易能扩增出来其他的东西。
 
最后，不要心急，遇到问题一个一个解决，荧光定量做起来不是很难，但是还是需要一些经验，

7. 实时荧光PCR无法自动设置阈值怎么解决

常见原因：该孔有异物；温度或荧光信号采集异常；该检测的反应体系中存在抑制物；提取核酸失败；样本采集不合格；样本/核酸漏加。2.5.3解决方案：打开PCR仪盖，查看孔内是否有异物，假如有异物，用镊子夹出异物，或用洗耳球吹出异物；分析前一批结果中，该孔内标是否扩增，假如连续两次内标无扩增，考虑该孔温度异常或荧光信号采集异常，需要进行校准或报修。排除以上情况后，对原标本复检，若内标正常可以正常发报告；若内标仍然无扩增，则需重新采样复检。【摘要】
实时荧光PCR无法自动设置阈值怎么解决【提问】
稍等【回答】
【回答】
【回答】
【回答】
【回答】
Biosystems™荧光定量PCR软件，默认都是自动设置阈值线。



就是说，当我们点击Analyze（分析）按钮时，软件会自动为我们的实验设置好最佳阈值线。请注意，我们的软件会分别为每种Assay单独设置阈值线。这是非常必要的，因为不同的assay的最佳阈值线是不同的。【回答】
数据来源：个人图书馆【回答】
【提问】
【提问】
【提问】
这种情况是什么原因，阳性对照没有起跳线也没有cq值，呈直线。是不是实时荧光PCR仪坏了？【提问】
常见原因：样本中可能存在干扰物质、提取纯化不完全、PCR仪热盖出现异常等。

2.3.3解决方案：复测；重新提取，或使用不同试剂盒提取。【回答】
常见原因：该孔有异物；温度或荧光信号采集异常；该检测的反应体系中存在抑制物；提取核酸失败；样本采集不合格；样本/核酸漏加。

2.5.3解决方案：打开PCR仪盖，查看孔内是否有异物，假如有异物，用镊子夹出异物，或用洗耳球吹出异物；分析前一批结果中，该孔内标是否扩增，假如连续两次内标无扩增，考虑该孔温度异常或荧光信号采集异常，需要进行校准或报修。排除以上情况后，对原标本复检，若内标正常可以正常发报告；若内标仍然无扩增，则需重新采样复检。【回答】
【回答】
荧光PCR常见异常结果分析

搜狐网  上有很多情况的详细说明【回答】
好的，谢谢【提问】
不客气，希望能够对你有所帮助。[太阳]【回答】

8. 荧光定量pcr常用的是什么方法

荧光定量pcr常用的是什么方法
用已知浓度的DNA样本（通常是质粒）梯度稀释成一系列的样本。做实验的时候，这些标准品和待测样本加在同样一块96孔盘的不同孔内。一起做PCR。

标准品的荧光强度和已知的浓度作图，可以得到一条标准曲线。而待测样本的荧光强度测出以后，就可以在标准曲线上算出样本浓度了。